生命科学实验指南系列：精编蛋白质科学实验指南

　　目录译者的话前言参编者推荐的背景读物第1章 蛋白质纯化和定性的策略 11.1单元 蛋白质纯化和定性概述 1目标和研究对象 1蛋自质纯化的原料 2蛋白质的检测和分析 3蛋白质分离和纯化方法 3蛋白质产物的定性 4蛋白质纯化实验室 51.2单元 蛋白质纯化流程图 6可榕性重组蛋白 6不可溶性重组蛋白 7可溶性非重组蛋白 8膜相关的和不可溶性重组蛋白 10第2章 计算分析 122.1单元 用于蛋白质序列分析的疏水分布图 12方法学 13应用 14结论 162.2单元 蛋白质二级结构预测 17二级结构预测的方法 17二级结构预测方法的应用 202.3单元 使用BLAST 程序家族进行序列相似性搜索 22进入BLAST程序和文档 22BLAST介绍 22BLAST程序 242.4单元 因特网上的蛋白质数据库 27蛋白质结构数据库 28蛋白质家族数据库 292.5单元 蛋白质三级结构预测 30同源性建模 31序列分布图法 32线程法 33从头结构预测 332.6单元 蛋白质三级结构建模 34词汇 34进入Swiss Model程序和文档 34ExPDB数据库 35创建首次法建模查询的格式 35观看Swiss Model结果 362.7单元 比较蛋白质结构预测 36比较建模的步骤 36第3章 检测和分析方法413.1单元 分光光度法确定蛋白质浓度 42基本方案1 计算一个蛋白质的摩尔吸收系数 42基本方案2 折叠蛋白质摩尔吸收系数的测定 42基本方案3 使用摩尔吸收系勤匾过吸收光谱测定蛋白质的浓度 43基本方案4 通过205nm处的吸收光谱测定蛋白质的浓度 43基本方案5 粗蛋白质提取霞总蛋白质浓度的测定 443.2单元 定量氨基酸分析45样品制备 45平均组成的讨算 453.3单元 肤和蛋白质的体外放射标记 47基本方案1 使用腆珠对醋氨酸或组氨酸残基进行腆化 47备择方案1 用氯胶T或Iodog锢在酷氨酸或组氯酸残基腆化 49备择方案2 使用乳酸过氧化物酶在氨酸或组氨酸残基腆化 49辅助方案1 等摩尔腆化以获得产物的高收率 50辅助方案2 用HPLC从模化产物中分离未标记的肤 50基本方案2 用Bolton-Hunter试剂在赖氨酸残基或N 端腆化 51基本方案3 通过酸酣乙酷化在赖氨酸残基或N端进行14C或3H标记 52备择方案3 通过还原性展基化在赖氨酸残基或N端进行14C或3H标记 53备择方案4 用腆乙酸或腆乙酷股在赖氨酸残基进行14C或3H标记 54基本方案4 在肤合成过程中引人麟己的氨基酸残基 54备择方案5 在肤合成过程中在N端进行选择性标记 553.4单元 总蛋白质的分析 56基本方案1 总蛋白质定量的双缩分析 57基本方案2 总蛋白质定量的Hartree- Lowry分析 57基本方案3 总蛋白质定量的二喹啉甲酸（BCA）分析 58基本方案4 总蛋白质定量的酸消化一一茚三酮法 58辅助方案1 热封玻璃管 59基本方案5 测量总蛋白质的考马斯染料结合分析（Bradford 分析） 60辅助方案2 蛋白质样品的提肢透析 60辅助方案3 蛋白质样品的主氯醋酸沉淀 613.5单元 溶液中和细胞表面上蛋白质的生物素化 62基本方案l 将生物素共价连接到赖氨酸上 62基本方案2 将生物素共价连接到魏基上63辅助方案1 二硫键的还原 64辅助方案2 生物素化蛋自质的检测 643.6单元 用氨基酸进行代谢标记 65基本方案用[35S]甲硫氨酸对悬浮细胞进行脉冲标记 65备择方案1 用[35S]甲硫氨酸对贴壁细胞进行脉冲据记 66备择方案2 用[35S]甲梳氨酸对细胞进行脉冲追踪标记 67备择方案3 用[35S]甲硫氨酸对细胞进行长期标记 67辅助方案用TCA 沉淀确定标记掺入 67第4章 提取、稳定和浓缩 694.1单元 用透析和超滤法脱盐、浓缩和更换缓冲液 69基本方案1 用再生纤维素透析袋进行脱盐、浓缩和更换缓冲液 69基本方案2 用不对称圆盘膜超撞进行浓缩或透析 71备择方案1 用切向流超掉进行渗谴或浓缩 73备择方案2 用离心式超滤器进行微量浓缩和脱盐 744.2单元 蛋白质的选择性沉淀 75策略设计 75基本方案l 用盐析选择性沉淀 76备择方案1 用分步盐析选择性沉淀 78基本方案2 用等离子沉淀选择性沉淀：柱法 78备择方案2 用等离子沉淀选择性沉淀：透析法 80基本方案3 使用G4和C5有机共溶剂选择性沉淀 80基本方案4 使用蛋白质排阻和拥挤剂及渗透物选择性沉淀 81基本方案5 使用合成的和半合成的聚合电解质选择性沉淀 82基本方案6 使用金属和多盼杂多阴离子选择性沉淀 834.3单元 蛋白质的长期保存 84蛋白质聚集 84化学阵解 85在不冻的水溶液中保存 85以盐析沉淀物的形式保存 86以冻结溶液的形式保存 86以冻干固体的形式保存 87选择适当的保存方法 89蛋自酶的抑制 89第5章 重组蛋白的生产 905.1单元 在大肠杆菌中生产重组蛋自 915.2单元 大肠杆菌表达系统的选择 92基本方案l 在PL启动于控制下的表达：温度诱导 94基本方案2 在trp启动子控制下的表达：化学诱导 94备择方案1 在lac/tac配启动子控制下的表达 95备择方案2 T7 RNA聚合酶/启动于表达系统 95辅助方案1 菌株保存 96辅助方案2 SDS-PAGE分析样品的制备 96辅助方案3 可溶性分析 97辅助方案4 周质提取物的制备 97辅助方案5 细胞外培养基样品的制备 985.3单元 最适宜于蛋白质生产的大肠杆菌的发酵和生长 99基本方案以分批发酵的方式生产重组蛋白 99备择方案1 用重金属衍生物进行重组蛋白的体内标记 101备择方案2 重组蛋白的稳定同位素标记 102辅助方案1 监测生长 103辅助方案2 检查元菌度 1035.4单元 在杆状病毒系统中的蛋白质表达 103基本方案1 病毒贮液的大规模生产 104基本方案2 表达动力学的确定 105基本方案3 在生物反应器中生产 106备择方案 用灌注培养生产 107辅助方案 收获 1085.5单元 用于生产外源蛋白质的酵母培养 108基本方案1 使用酿酒酵母半乳静调控的载体小规模表达 109备择方案l 使用葡萄糖阻抑型ADH2 载体表达 110备择方案2 使用带糖酵解基因启动子的载体表达 110基本方案2 在巴斯德毕赤酵母中小规模表达 111辅助方案 蛋白质提取物的小规模制备 1125.6单元 哺乳动物细胞蛋白质表达的概况 1135.7单元 在哺乳动物细胞中生产重组蛋白 115基本方案1 用碱裂解/回离子交换捕在法纯化质粒 116基本方案2 用脂质体转染法转染细胞 117基本方案3 用遗传霉素（G418）进行新霉素磷酸转移酶（NPT 11）的选择 118辅助方案 对G418背景敏感性的确定 119基本方案4 用氨甲蝶岭（MTX）扩增二氢叶酸还原酶（DHFR） 119基本方案5 通过多次传代使悬浮细胞适应生产培养基 120基本方案6 细胞在大规模转瓶中以分批的方式生长 122基本方案7 细胞在大规模分批反应器中的生长 124备择方案 在生物反应器中连续培养细胞的生长 125基本方案8 从转瓶培养物和大规模反应器中收获分部的产物 126基本方案9 从转瓶培养物的大规模反应器中收获与细胞相关的产物 1285.8单元 细胞培养物和症病毒贮液的制备 128基本方案1 单层细胞的培养 129基本方案2 悬浮细胞的培养 130基本方案3 症病毒贮液的制备1315.9单元 重组症病毒的构建 132基本方案1 用症病毒载体转染症病毒感染的细胞 133基本方案2 重组病毒噬斑的选择和筛选 136基本方案3 噬斑的扩增 1385.10单元 细胞蛋白质表达系统的选择 1395.11单元 使用Gateway 系统在多种宿主中进行蛋白质表达 143第6章 重组蛋白的纯化 1476.1单元 在大肠杆菌中生产的重组蛋白的纯化概述 149确定溶解度 150蛋白质定位 151分离可溶性蛋白质 153分离不可溶性蛋白质 1536.2单元 从大肠杆菌中制备可榕性蛋白质 155基本方案 在大脑杆菌中可溶性表达的一种蛋白质：白细胞介素晴的纯化 1566.3单元 从大肠杆菌中制备和提取不溶性（包含体）蛋白质 161基本方案1 从大肠杆菌中制备和提取不需性（包含体）蛋白质 161基本方案2 在盐酸皿存在的情况下进行中压凝肢过滤层析 1626.4单元 蛋白质折叠概述 164蛋白质是怎样折叠的 164怎样折叠蛋白质 1666.5单元 大肠杆菌不榕性（包含体）蛋自质的折叠和纯化 170基本方案1 牛生长激素的折叠和纯化 170基本方案2 人自细胞介素的折叠和纯化 173基本方案3 带组氨酸标签蛋白质的折叠和纯化：HIV-l整合酶 1746.6单元 GST融合蛋白的表达和纯化 177基本方案1 谷眈甘肽S 转移酶融合蛋白的表达 178基本方案2 可溶性GST 融合蛋白的亲和层析纯化 179备择方案 用亲和层析从包含体中纯化GST 融合蛋白 181基本方案3 蛋白酶切割融合蛋白溶液以除去GST 亲和标签 1816.7单元 硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化 182基本方案 硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达 182辅助方案 硫氧还蛋白融合蛋白的渗透压释放 185第7章 重组蛋白的定性 1867.1单元 重组蛋白定性概述 1887.2单元 用紫外吸收光谱法测定重组蛋自的一致性和纯度 190基本方案 用近紫外光谱法分析蛋白质 1907.3单元 测定重组蛋白的一致性和结构 194基本方案 测定重组蛋自的二硫键模式 1947.4单元 横向尿素梯度电泳 197基本方案 1977.5单元 分析型超速离心 2007.6单元 测定蛋白质的圆二色谱 201基本方案 记录CD谱 203辅助方案 远紫外CD谱的解释 2057.7单元 测定蛋白质的荧光光谱法 205基本方案 记录荧光发射光谱 2077.8单元 用差示扫描量热法测量蛋白质的热稳定性 209基本方案 差示扫描量热法 209辅助方案1 电校准 2

　　《精编蛋白质科学实验指南》是《*新蛋白质科学实验指南》（Current Protocols in Protein Science；CPPS）一书的精编版本，内容全部取材于《精编蛋白质科学实验指南》和每季度更新的服务手册，其详细提供了多种实验方案，并包含实验材料、步骤和每种技术的参考文献等信息，可使有经验的研究人员将其作为独立的实验室指南来使用。　　由于蛋白质具有多样性，其分析也必须包括很广范的结构和理化方法，因此每个研究人员都必须尽可能多地掌握新方法和传统方法。本指南中既包括特定的详细方案，也包括使方法适应于头特定项目的策略，相信能够有助于读者进一步深入进行蛋白质科学和相关领域的研究。